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枯草杆菌黑色变种芽胞悬液的制备方法


 1.以无菌操作方式开启菌种管,加入适量营养肉汤培养基,吹吸数次,使菌种融化分散。取含5.0 mL~10.0 mL营养肉汤培养基试管,滴入少许菌种悬液,置36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于营养琼脂培养基平板上,置36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。挑取上述第2代培养物中典型菌落,接种于营养肉汤培养基,置36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h,即为第3代培养物。 

  2.用10.0 mL吸管吸取5.0 mL~10.0 mL第3代~5代的18 h~24 h营养肉汤培养物,接种于罗氏瓶(或细胞培养瓶)营养琼脂培养基表面,将其摇动使菌液布满培养基表面,将多余肉汤培养物吸出,罗氏瓶(或细胞培养瓶)置36 ℃±1 ℃恒温培养箱内培养5 d~7 d。

  3.用接种环取少许菌苔涂于玻片上,以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法:用接种环取菌苔涂于玻片上,自然干燥后,通过火焰加热将菌固定于玻片上;将涂片放入平皿内,片上放两层滤纸,滴加足量的5.0%孔雀绿水溶液,将平皿盖好,置55 ℃±1 ℃加热30 min。取出,去滤纸,用自来水冲去残留液;加0.5%沙黄水溶液,1 min后水洗,待干后镜检。芽胞呈绿色,菌体呈红色。在显微镜(油镜)下镜检,当芽胞形成率达90%以上时,即可进行以下处理。否则,继续在室温下放置一定时间,直至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理。

  4.加10.0 mL无菌蒸馏水于罗氏瓶(或细胞培养瓶)中,以L棒轻轻刮下菌苔,吸出,再加入5.0 mL无菌蒸馏水冲洗培养基表面,吸出。将两次吸出的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌锥形烧瓶中,振摇5 min。 

  5.将烧瓶置45 ℃水浴24 h,使菌自溶断链,分散成单个芽胞。

  6.用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液,清除琼脂凝块。

  7.将芽胞悬液置无菌离心管内,以3000 r/min速度离心30 min。弃上清液,加蒸馏水吹吸使芽胞重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗,本步骤重复进行3遍。

  8.将洗净的芽胞悬液放入含适量小玻璃珠的烧瓶内,80 ℃水浴10 min(或60 ℃水浴30 min),以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后,摇匀分装后冷藏保存备用,有效使用期6个月。

  9.芽胞悬液在使用时,先进行活菌培养计数。

  10.怀疑有污染时,以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。

  本文节选自中华人民共和国卫生行业标准《WS/T 683—2020消毒试验用微生物要求》。


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