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培养基的实验室制备


1 一般要求 

正确制备培养基是微生物检验的最基础步骤之一,使用脱水培养基和其他成分,尤其是含有有毒物质(如胆盐或其他选择剂)的成分时,应遵守良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。培养基的不正确制备会导致培养基出现质量问题(见附录A)。 

使用商品化脱水合成培养基制备培养基时,应严格按照厂商提供的使用说明配制。如重量(体积)、pH、制备日期、灭菌条件和操作步骤等。 

实验室使用各种基础成分制备培养基时,应按照配方准确配制,并记录相关信息,如:培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积(分装体积)、无菌措施(包括实施的方式、温度及时间)、配置日期、人员等,以便溯源。 

2 水 

实验用水的电导率在25℃时不应超过25 μS/cm(相当于电阻率≥0.4 ΜΩcm),除非另有规定要求。 

水的微生物污染不应超过10CFU/mL。应按GB 4789.2,采用平板计数琼脂培养基,在36 ±1 ℃培养48 h±2 h进行定期检查微生物污染。 

3 称重和溶解 

小心称量所需量的脱水合成培养基(必要时佩戴口罩或在通风柜中操作,以防吸入含有有毒物质的培养基粉末),先加入适量的水,充分混合(注意避免培养基结块),然后加水至所需的量后适当加热,并重复或连续搅拌使其快速分散,必要时应完全溶解。含琼脂的培养基在加热前应浸泡几分钟。 

4 pH 的测定和调整 

pH计测pH,必要时在灭菌前进行调整,除特殊说明外,培养基灭菌后冷却至25 ℃时,pH应在标准pH±0.2范围内。一般使用浓度约为40 g/L(约1 mol/L)的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L(约1 mol/L)的盐酸溶液调整培养基的pH。如需灭菌后进行调整,则使用灭菌或除菌的溶液。 

5 分装 

将配好的培养基分装到适当的容器中,容器的体积应比培养基体积最少大20%。 

6 灭菌 

6.1 一般要求 

培养基应采用湿热灭菌法或过滤除菌法。 

某些培养基不能或不需要高压灭菌,可采用煮沸灭菌,如SC肉汤等特定的培养基中含有对光和热敏感的物质,煮沸后应迅速冷却,避光保存;有些试剂则不需灭菌,可直接使用(参见相关标准或供应商使用说明)。 

6.2 湿热灭菌 

湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行,高压灭菌一般采用121 ±3 ℃灭菌15 min,具体培养基按食品微生物学检验标准中的规定进行灭菌。培养基体积不应超过1000 mL,否则灭菌时可能会造成过度加热。所有的操作应按照标准或使用说明的规定进行。 

灭菌效果的控制是关键问题。加热后采用适当的方式冷却,以防加热过度。这对于大容量和敏感培养基十分重要,例如含有煌绿的培养基。 

6.3 过滤除菌 

过滤除菌可在真空或加压的条件下进行。使用孔径为0.2 μm的无菌设备和滤膜。消毒过滤设备的 

各个部分或使用预先消毒的设备。一些滤膜上附着有蛋白质或其他物质(如抗生素),为了达到有效过滤,应事先将滤膜用无菌水润湿。 

6.4 检查 

应对经湿热灭菌或过滤除菌的培养基进行检查,尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行检查。 

7 添加成分的制备 

制备含有有毒物质的添加成分(尤其是抗生素)时应小心操作(必要时在通风柜中操作),避免因粉尘的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应;制备溶液时应按产品使用说明操作。 

不要使用过期的添加剂;抗生素工作溶液应现用现配;批量配制的抗生素溶液可分装后冷冻贮存,但解冻后的贮存溶液不能再次冷冻;厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的有关资料,也可由使用者自行测定。 

 


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