菌种保藏指南：常见方法、优缺点及适用场景

在微生物学研究、工业生产（如食品、酿酒、抗生素、酶制剂）以及医学检验等领域，菌种的纯正性、活性和遗传稳定性是一切工作的基石。菌种保藏，顾名思义，就是采用各种技术手段，使微生物菌种能够长期、稳定地保存，避免死亡、污染和变异。一个有效的保藏方案能节省大量重复筛选和鉴定菌种的时间与成本。

本文将介绍几种常用的菌种保藏方法，详细分析其优缺点，并帮助您根据实际场景选择最合适的方案。

一、 常规传代保藏法

这是最经典和简单的方法，包括斜面传代和半固体穿刺培养。

原理： 将菌种接种在新鲜的固体或半固体培养基上，待其生长后，通常置于4°C冰箱中保存，定期进行转接。

优点：

操作简单，无需特殊设备。

成本低廉，易于观察菌种状态（是否污染、生长情况）。

缺点：

保藏时间短： 通常只能保存1-3个月，需频繁转接，工作量大。

易变异： 多次传代容易导致菌种发生退化、突变或染菌。

易污染： 操作过程中开放环境，污染风险较高。

适用场景：

实验室短期（数周至数月）内频繁使用的活性工作菌种。

教学实验、日常检验等对保藏期限要求不高的场合。

二、 液体石蜡覆盖保藏法

是常规传代保藏法的加强版，旨在延长保藏时间。

原理： 在生长良好的斜面或穿刺培养物上，无菌地覆盖一层经过灭菌的液体石蜡。石蜡层能有效隔绝空气，防止培养基水分蒸发，并抑制好氧菌的生长，使菌种处于休眠状态。

优点：

延长保藏期： 可将保藏时间延长至1-2年。

操作相对简单，无需昂贵设备。

缺点：

保存和搬运不便（有液体）。

石蜡层密封不严仍可能导致培养基干涸。

不适用于所有微生物（例如，某些利用烃类的菌株会分解石蜡）。

转接时，蘸有石蜡的接种环火焰灭菌时易爆溅，需小心操作。

适用场景：

某些真菌、放线菌和酵母菌的中期保藏。

缺乏超低温或冻干设备的小型实验室。

三、 甘油管冷冻保藏法

目前实验室最常用、最普遍的长期保藏方法之一。

原理： 将菌悬液与无菌甘油混合（最终甘油浓度一般为15%-30%），然后分装至冻存管中。甘油作为冷冻保护剂，能降低冰晶的形成，防止冰晶刺破细胞膜。随后将冻存管置于超低温环境（-80°C）或液氮（-196°C）中。

优点：

保藏期长： -80°C可保存1-5年，液氮中可保存10年以上。

遗传稳定性好： 低温极大降低了菌株的代谢活动和变异概率。

操作简便： 可一次性制备大量备份，随用随取，复活率高。

缺点：

依赖-80°C超低温冰箱或液氮罐等设备。

有断电或设备故障导致菌种全部损失的风险（需多地点备份）。

适用场景：

绝大多数实验室的首选方案，适用于细菌、酵母等多种微生物的长期备份保藏。

适用于需要建立菌种库的场合。

四、 磁珠保藏法

是甘油冷冻保藏的一种商业化、标准化改进。

原理： 使用表面有凹槽和保护剂的无菌小磁珠。将菌液与磁珠混合，菌体吸附于磁珠上，吸走多余菌液后，将磁珠管直接投入超低温环境保存。使用时，用无菌镊子取出一颗磁珠即可在平板上划线复活。

优点：

复活方便快捷，避免反复冻融对主管的损伤。

标准化生产，稳定性高，重复性好。

一管多珠，相当于多个备份。

缺点：

磁珠和耗材成本较高。

本质上仍需超低温设备。

适用场景：

临床检验、质量控制等需要频繁取用菌种且要求标准化的实验室。

高通量菌种管理的场合。

五、 冷冻干燥保藏法（冻干保藏）

被公认为最可靠、最有效的长期保藏技术，是菌种保藏中心的标配方法。

原理： 将菌悬液在极低温度（预冻）下快速冻结，然后在高真空状态下使冰直接升华（冷冻干燥），最终获得干燥的、处于休眠状态的菌粉。菌粉在真空或惰性气体（如氮气）封存下保存。

优点：

保藏期极长： 5-20年甚至更久。

遗传稳定性极佳： 干燥状态下代谢完全停止，不易变异。

易于运输： 安瓿管体积小、重量轻，无需冷藏即可邮寄。

缺点：

设备昂贵： 需要专用的冷冻干燥机。

操作复杂： 技术要求高，流程长。

并非所有菌种都耐受冻干过程（如不产孢子的丝状真菌）。

适用场景：

菌种保藏中心 用于长期保存和提供标准菌株。

需要永久备份极其重要、珍贵的菌种。

需要长途运输商业菌种。

六、 液氮超低温保藏法

保藏效果最好的方法，堪称菌种的“诺亚方舟”。

原理： 在添加了保护剂（如DMSO或甘油）的菌悬液中，通过程序性缓慢降温，最终置于-196°C的液氮中保存。在此温度下，所有生理活动几乎完全停止。

优点：

保藏效果最佳： 适用于几乎所有微生物，包括不耐冻干的藻类、原生动物等。

保藏期最长： 理论上可无限期保存。

遗传稳定性最高。

缺点：

设备运行和维护成本极高（液氮消耗）。

存在液氮泄漏、冻伤等安全风险。

操作最复杂，需严格控制降温程序。

适用场景：

国家级菌种保藏中心。

保藏极其脆弱、珍稀或具有重大经济价值的菌种。

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总结与选择建议

为了方便您快速选择，下表总结了各方法的特点：

保藏方法	保藏期限	主要优点	主要缺点	适用场景
常规传代	1-3个月	简单、成本低、易观察	时间短、易变异、易污染	短期、频繁使用的活性菌种
液体石蜡	1-2年	延长斜面保藏时间、简单	搬运不便、不适用所有菌种	中小实验室某些菌种的中期备份
甘油冷冻	1-10年+	时长适中、稳定性好、通用	依赖超低温设备	实验室首选长期方案，建立菌种库
磁珠保藏	1-10年+	复活方便、标准化	成本较高	需频繁取用、标准化的QC或临床实验室
冷冻干燥	10-20年+	时长极长、稳定、便于运输	设备昂贵、操作复杂	菌种中心长期保藏、商业菌种、珍贵菌种备份
液氮超低温	理论上无限	效果最佳、适用菌种最广	成本极高、操作复杂且危险	保藏中心、珍稀脆弱菌种

选择指南：

日常使用： 准备常规斜面用于近期实验，同时制备甘油冷冻管作为中期备份存入-80°C冰箱。

重要菌种： 对于专利菌株、工程菌或经过漫长筛选得到的珍贵菌种，至少应采用甘油冷冻管进行多份备份，并考虑委托专业机构进行冷冻干燥或液氮保藏，实现异地备份。

特殊菌种： 对于不产孢子的丝状真菌等脆弱菌株，液氮保藏可能是最佳甚至唯一的选择。

原则： 无论采用何种方法，定期复核保藏菌种的存活率、纯度和特性都是必不可少的关键步骤。