实验室微生物菌种的分离和纯化常用的方法

微生物菌种的分离和纯化是微生物学研究与应用的基础步骤。常用的方法主要基于微生物在固体培养基上形成单个、可见的菌落的原理。以下是实验室中最常用的几种方法：

一、 核心原理

分离： 将混合的微生物群体分散开，使单个微生物细胞（或孢子）在固体培养基表面或内部生长，形成彼此分开的单个菌落。理论上，一个菌落是由一个微生物细胞繁殖而来的纯种后代（克隆）。

纯化： 将分离得到的单个菌落再次进行分离培养（通常至少重复一次），以确认其确实来源于单个细胞，确保培养物中只含有一种微生物，即获得纯培养。

二、 常用分离和纯化方法

1、平板划线法：

原理： 用接种环蘸取少量含菌样品（混合菌液或环境样本悬液），在已凝固的固体平板培养基表面进行有规律的划线。随着划线次数的增加，接种环上的菌液被逐渐稀释。最终，在划线的末端，单个微生物细胞得以分散开，经培养后形成单个、孤立的菌落。

优点： 操作简便、快速、无需特殊设备，是最常用、最基础的分离纯化方法。

缺点： 分离效果受操作者技术熟练度影响较大；难以精确计数原始样品中的微生物数量。

步骤： 分区划线法（如四区划线法）是最常用的，确保在后面的划线区域得到单菌落。

2、稀释涂布平板法：

能获得单菌落。

能对样品中的微生物进行活菌计数（选择形成30-300个菌落的平板计数）。

适合分离在培养基表面生长的好氧菌。

分离效果相对稳定，受操作者个体差异影响较小。

原理： 将待分离的样品进行一系列梯度稀释（如10倍系列稀释）。取一定量（通常是0.1mL）的某一稀释度的稀释液，滴加到固体平板培养基表面，然后用无菌涂布棒将其均匀涂布在整个平板表面。经培养后，分散的单个细胞生长形成单个菌落。

优点：

缺点： 操作步骤稍多（需稀释），需要涂布棒；涂布过程可能损伤某些娇嫩的微生物；对严格厌氧菌不适用（除非在厌氧条件下操作）。

步骤： 样品稀释 → 取稀释液加入平板 → 涂布均匀 → 培养。

3、倾注平板法：

原理： 取一定量（通常是1mL）的某一稀释度的稀释液，加入到无菌培养皿中。然后将融化并冷却至约45-50℃（不烫手）的固体培养基倒入培养皿中，迅速轻轻旋转混匀。待培养基凝固后培养。样品中的微生物细胞被固定在琼脂内部或表面，生长形成菌落。

优点：

能获得单菌落。

能对样品中的微生物进行活菌计数。

适合分离兼性厌氧菌和厌氧菌（因为部分菌落生长在琼脂内部，氧气浓度较低）。

操作相对简单。

缺点：

菌落可能分布在琼脂内部，挑取单菌落不如表面生长的方便（需穿刺或切开琼脂）。

热敏感的微生物可能被融化培养基的温度（45-50℃）损伤。

观察菌落形态（尤其是表面特征）不如表面生长的清晰。

不适合分离严格好氧菌（内部缺氧）

步骤： 样品稀释 → 取稀释液加入无菌培养皿 → 倒入融化冷却的培养基 → 混匀 → 凝固 → 培养。

4、单细胞分离法 (显微操作法)：

原理： 在显微镜下，使用极其精细的显微操作器（如显微针、毛细管）直接从样品中挑取单个微生物细胞，然后将其转移到无菌培养基中进行培养，获得纯培养物。

优点： 理论上是最直接、最可靠的获得纯培养的方法。

缺点： 需要昂贵的显微操作设备；操作技术要求极高、非常耗时；对操作者技能要求苛刻；成功率相对较低（单个细胞可能不易生长）。

应用： 主要用于特殊研究，如分离难以培养的微生物、研究极端环境微生物、或对纯度要求极高的场合。

三、 纯化步骤

无论采用上述哪种分离方法获得单个菌落，通常都需要进行至少一次（有时需要多次）的再纯化，以确保培养物的纯度：

1、从第一次分离平板上的典型目标单菌落边缘挑取少量菌体。

2、用平板划线法（最常用）在新的平板上再次划线分离。

3、培养后，观察新平板上生长的菌落。如果所有菌落形态、大小、颜色等特征完全均一，通常可以认为获得了纯培养。

4、对于要求严格的情况（如分类鉴定、保藏），可能需要重复步骤1-3一次。

四、 关键注意事项

1、无菌操作： 整个分离纯化过程必须在无菌环境（超净工作台或酒精灯旁）下进行，使用无菌器材，严格遵守无菌操作规程，防止杂菌污染。

2、培养基选择： 选择适合目标微生物生长的培养基（营养成分、pH、渗透压等）。有时需要使用选择性培养基（抑制非目标菌生长）或鉴别性培养基（使目标菌显示特定特征）来提高分离效率。

3、培养条件： 提供目标微生物适宜的温度、气体环境（好氧、厌氧、微需氧）、光照等培养条件。

4、样品处理： 环境样品（土壤、水、食品等）通常需要制成均匀的悬液，并可能进行预处理（如静置沉降大颗粒、过滤、热处理去除营养细胞保留孢子等）。

5、梯度稀释： 对于涂布法和倾注法，进行足够倍数的系列稀释至关重要，以确保能获得形成合适数量（30-300个）单菌落的平板。

6、菌落观察与挑选： 仔细记录原始菌落的形态特征，挑选典型、孤立、生长良好的单菌落进行纯化。注意区分目标菌落和可能的污染菌落。

7、验证纯度： 纯化后，需通过显微镜检查（观察细胞形态是否一致）、平板划线检查（再次划线观察菌落是否均一）、有时还需结合生理生化试验或分子生物学方法（如16S rRNA基因测序）来最终确认培养物的纯度。

总结：

平板划线法和稀释涂布平板法是实验室最常用、最实用的分离纯化好氧和兼性厌氧微生物的方法。

倾注平板法适用于计数和分离厌氧或兼性厌氧菌。

单细胞分离法用于特殊需求的高纯度分离。

再纯化是获得纯培养的必要步骤。

无菌操作、合适的培养基和培养条件是成功分离纯化的关键保障。

选择哪种方法取决于目标微生物的类型、样品来源、实验目的（是否需定量）以及实验室条件。熟练掌握这些基本技术是进行微生物学研究和应用的基础。