平板菌落计数法

平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数。以下是关于平板菌落计数法的详细介绍：

### 一、原理

将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

### 二、操作要点

1. **培养基的配制**：首先，应选取适用于待培养菌种生长的培养基进行配制，注意应计算所需平板的数量，并适当放大平板数量，以防止实验过程中出现额外需求。经高压灭菌锅灭菌后，待培养基冷却至45-50℃进行倒平板，此处应注意，在倒平板前，应先将培养基充分摇匀。
2. **菌液的配制**：先将待测定的微生物样品，如冷冻保藏的菌种，经过平板划线法进行接种后，从平板中挑取单个菌落，按比例作一系列稀释（通常为10倍系列稀释法）。初始阶段，可使用浊度仪协助菌液中微生物数量的判定。
3. **平板涂布**：通常根据经验，定量吸取某几个稀释度的菌悬液于第一步制得的培养基中，用涂布棒进行涂布。经培养后，将各平板中计得的菌落数的平均值换算成单位体积的含菌数，再乘以样品的稀释倍数，即可测知原始菌样的单位体积中所含的活细胞数。

若采用倾注法，则配制完各个稀释倍数的菌液后，取等量不同的菌液稀释液分别用移液管加入各个培养皿，将45-50℃的培养基加入各个已加有不同稀释倍数菌液的培养皿中，与菌液充分摇匀培养基后，将平板水平静置至凝固后倒置放入恒温箱中培养即可。

### 三、注意事项

1. **稀释与涂布**：在菌样的测定中必须使样品中的细胞（或孢子）充分均匀地分散，且经适当地稀释，使平板上所形成的菌落数控制在适当的范围，一般细菌的平板菌落计数以30-300个为宜，这样可以减少计数与统计产生的误差。
2. **无菌操作**：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
3. **培养条件**：培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15%。
4. **菌落计数**：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。

### 四、应用

平板菌落计数法常用于微生物的选种与育种、分离纯化及其他方面的测定。此外，在食品卫生检测领域，菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量的重要方法。

### 五、优缺点

* **优点**：能测出样品中的活菌数。
* **缺点**：操作手续较繁，时间较长，测定值常受各种因素的影响。

总的来说，平板菌落计数法是一种重要的微生物检测技术，具有广泛的应用价值。