一、 原理：低温与保护的完美结合
瓷珠菌种保存法的核心在于巧妙利用多孔结构瓷珠与低温保护剂（通常为甘油）的协同效应：
吸附与负载： 特殊工艺制造的瓷珠表面布满微孔，拥有巨大的比表面积。当菌体悬浮液与瓷珠混合时，微生物细胞（细菌、酵母等）被有效吸附并嵌入这些微孔结构中。
低温保护： 加入20%-30%浓度的甘油溶液。甘油作为经典的低温保护剂，能在降温过程中渗入细胞，显著降低细胞内冰晶的形成速度和体积，从而保护细胞膜和内部结构免受冻伤破坏。
深度冻结： 负载了菌体-甘油混合液的瓷珠被置于-60℃至-80℃超低温冰箱或液氮气相（约-150℃）中长期保存。极低的温度极大抑制了微生物的代谢活动，使其处于“休眠”状态。
稳定环境： 瓷珠的微孔结构为菌体提供了一个相对稳定的物理微环境，减少了冰晶重结晶等物理损伤的风险。
二、 所需材料与试剂
无菌瓷珠保存管： 内含数十至数百颗无菌、无DNA酶/RNA酶的多孔小瓷珠（直径约2-3mm）。
保护剂： 无菌甘油溶液（常用浓度20%-30%，V/V，用去离子水或适宜缓冲液配制，高压灭菌）。
微生物菌种： 处于对数生长后期、活力旺盛的纯培养物（如细菌肉汤培养物、酵母菌悬液）。
菌悬液制备工具： 无菌吸管、移液器及无菌吸头、涡旋振荡器。
冷冻设备： -60℃至-80℃超低温冰箱，或液氮罐及配套冻存架/盒。
复苏工具： 恒温培养箱、无菌培养皿（含适宜固体培养基）、无菌镊子、酒精灯或接种环灭菌器、标记笔。
三、 标准操作流程
菌悬液制备：
刮取适量新鲜培养的菌苔（或收集离心后的菌体沉淀），悬浮于适量无菌生理盐水或液体培养基中。
根据预试验或经验，调整菌悬液浓度至约10^8 - 10^9 CFU/mL（通常相当于麦氏浊度3-4）。高密度有助于复苏成功。
（关键步骤）向菌悬液中加入等体积的无菌甘油溶液（如最终需20%甘油，则菌悬液与甘油按1：1混合），充分混匀（轻柔涡旋）。确保甘油终浓度在20%-30%之间。
瓷珠负载：
在无菌操作台（超净台）内，打开无菌瓷珠保存管。
用无菌吸管吸取适量混合好的菌悬液-甘油混合液（通常0.5-1mL），加入瓷珠保存管中，确保液体完全浸没瓷珠。
立即盖紧管盖。
混合与预冷：
将保存管置于涡旋振荡器上，轻柔地充分混匀1-2分钟，确保菌体均匀吸附到瓷珠上。避免剧烈震荡导致瓷珠破碎。
将混匀后的保存管置于冰上或4℃冰箱中预冷30分钟至1小时，使保护剂充分渗透入细胞。
冷冻保存：
将预冷后的瓷珠保存管迅速转移至-60℃至-80℃超低温冰箱，或直接放入液氮罐的气相中长期保存。
重要提示： 确保保存管始终处于稳定的超低温环境，避免温度反复波动。
复苏培养：
需要使用时，从超低温环境中快速取出目标保存管（避免瓷珠融化）。
在无菌操作台内，打开管盖。
用预冷过的无菌镊子迅速夹取一粒瓷珠。（注意：只需一粒！）
将这颗瓷珠轻轻在适宜的预温固体培养基平板表面滚动或划线，或者投入装有液体培养基的试管中。
若瓷珠表面液体过多，可在无菌滤纸上轻轻蘸一下（避免过度干燥）。
将平板或试管置于适宜温度下培养。
复苏后，立即将保存管放回超低温环境。
四、 核心优势
长期稳定性优异： 在-70℃或液氮中，大部分细菌、酵母可稳定保存5-10年甚至更长，活力下降缓慢，遗传性状稳定。
操作简便高效： 流程标准化程度高，无需特殊冷冻干燥设备或复杂程序。复苏时仅需取一粒珠子，极其方便快捷。
高复苏率与活性： 甘油保护和瓷珠微环境有效减少了冷冻损伤，通常能获得很高的活菌复苏率。
节省空间与成本： 小体积瓷珠管极大节省了宝贵的超低温存储空间。相比冷冻干燥，初始投入和日常维护成本更低。
减少传代污染与变异： 一次保存可长期使用，显著减少了因频繁传代导致的污染风险和菌种变异退化。
适用范围广： 适用于绝大多数细菌（包括苛养菌）、酵母。部分丝状真菌和放线菌也可尝试，但效果可能因菌种而异。
五、 关键注意事项
严格无菌操作： 整个流程（菌悬液制备、加甘油、加样、取珠复苏）必须在无菌条件下进行，防止污染。
甘油浓度精确： 浓度过低保护不足，过高则可能产生毒性或渗透压损伤。务必准确配制和添加。
菌体状态与密度： 使用对数生长期后期、健壮的菌体，保证足够高的初始菌悬液密度。
充分混合与预冷： 确保菌体与甘油均匀接触并被瓷珠有效吸附。预冷有助于甘油渗透。
快速冷冻与稳定保存： 操作要迅速，避免菌悬液在室温停留过久。保存环境温度必须稳定，波动是长期保存的大敌。
复苏取珠技巧： 使用预冷无菌镊子，只取一粒珠。避免夹取时造成污染或使管内其他瓷珠温度升高。蘸去多余液体可防止甘油抑制复苏生长。
清晰标识： 保存管上必须清晰、牢固地标明菌种名称、编号、保存日期、操作者等信息。建议建立电子数据库备份。
定期核查： 建议定期（如每年或每两年）对重要菌种进行复苏培养，验证其存活率和关键特性。
温馨提示：试剂为科研质控使用，不可用于临床及人体！非药用，非食用。