平板接种后无菌落？一步步教你排查原因与解决方案

菌种死亡/衰老： 原始菌种保存不当（反复冻融、保存时间过长、保存温度不当）、传代次数过多导致退化。

菌液制备错误：

活化失败： 复苏冷冻或干燥菌种时条件不合适，未成功复活。

培养条件错误： 制备菌液时温度、时间、培养基成分、pH、氧气条件等不符合该菌株要求。

浓度过低： 菌液未充分混匀、稀释过度或接种量计算错误，导致实际接种到平板上的活菌数远低于检测限（通常<10 CFU/平板）。

操作失误： 取错菌种、取空白培养基、忘记加菌。

样品问题： 环境样品、临床样品等本身含菌量极低或目标菌被抑制。

忘记接种： 最直接但容易被忽略的原因。

接种工具问题：

涂布棒过热： 酒精浸泡后未充分冷却或在火焰上灼烧后未冷却就接触菌液，烫死细菌。

涂布棒未灭菌或污染抑制剂。

接种量不足/不均： 取菌液量太少、未吸到菌液、涂布时菌液被涂布棒吸收过多或涂布不均匀导致局部无菌。

菌液未混匀： 细菌沉降在管底，吸取的上清液含菌量低。

接种方式错误： 倾注法时培养基温度过高烫死细菌。

配制错误： 成分称量错误、漏加关键成分（如碳源、氮源、生长因子）、pH调节错误（过酸或过碱）。

选择性过强： 添加的抑制剂（抗生素、染料、盐等）浓度过高或种类错误，不仅抑制了杂菌，也抑制了目标菌。

灭菌不当：

灭菌不彻底： 导致杂菌污染，但杂菌也可能因各种原因不生长或不易观察。

过度灭菌/过热： 高温高压时间过长或反复灭菌，导致培养基成分破坏（如碳源焦化、维生素失活）、pH改变、产生抑制性物质。

干燥/开裂： 平板倒置放置时间过长或环境过于干燥，导致培养基失水干裂，无法支持菌落生长。

琼脂浓度过高： 影响营养物质扩散，也可能物理限制某些菌的移动和生长。

含有残留消毒剂/抑制剂： 配制容器或水被污染。

温度错误： 培养箱温度设置错误、温度不均匀、未达到设定温度或温度波动过大。目标菌可能要求特定温度（如嗜冷菌、嗜热菌）。

气体条件错误：

需氧菌在厌氧环境： 未提供足够氧气。

厌氧菌在有氧环境： 未创造有效的厌氧环境（厌氧罐/袋失效、指示剂未显示厌氧）。

微需氧/嗜CO2菌未提供特定气体环境： 未使用蜡烛罐或CO2培养箱。

湿度不足： 培养箱内湿度过低导致平板干燥。

培养时间不足： 某些菌生长缓慢（如分枝杆菌、某些真菌），需要更长的培养时间（几天甚至几周）。

光照条件错误： 某些光合细菌需要特定光照。

阳性对照： 同时接种一个已知活力良好的同种或类似菌株到同一批次的培养基上，相同条件下培养。如果阳性对照长得好，问题出在样本或接种物本身；如果也不长，问题出在培养基、操作或培养条件。

阴性对照：

无菌水/缓冲液对照： 用无菌水代替菌液接种平板，检查培养基是否无菌或操作是否污染。

未接种平板对照： 留一个空白平板一同培养，检查培养基灭菌是否彻底、培养过程是否有污染。

培养基性能对照： 使用标准菌株测试新配制或新批次培养基是否支持其生长。

仔细回顾实验步骤：

逐步检查菌种来源、活化过程、菌液制备（浓度、混匀）、接种操作（工具冷却、取液量、涂布）、培养基配制记录（成分、pH、灭菌参数）、培养条件设置（温度、气体、时间）。

延长培养时间和改变观察方式：

将平板继续培养几天（甚至更长时间，根据目标菌特性），每天观察。

尝试在解剖镜下观察，或对平板进行染色（如TTC染色）以显示微小的菌落。

检查培养基和培养条件：

测试培养箱温度准确性（使用校准过的温度计）。

检查厌氧/CO2系统是否有效（使用厌氧指示剂）。

观察平板是否干燥开裂。

使用同一批培养基接种易生长的标准菌（如大肠杆菌）测试其支持生长的能力。

重复实验：

使用新鲜的菌种/菌液（重新活化或制备）。

使用新配制的培养基。

严格规范操作步骤，特别注意接种工具的冷却、菌液混匀、接种量。

确保培养条件设置正确并稳定。

考虑样品特性：

如果样品可能含抑制剂，尝试稀释样品、使用中和剂或选择能中和抑制剂的培养基。

对于含菌量低的样品，使用滤膜浓缩法或大体积接种。

安全考虑：

如果怀疑长出的可能是致病菌（即使不是目标菌），务必在生物安全柜内操作，按照安全规程处理平板。