在生物学实验室里，菌株如同我们的“宝藏”，是研究成果的基石和延续的保障。一次意外的污染、一次不经意的操作失误，都可能让耗费数月甚至数年心血筛选、构建的菌株毁于一旦。因此，科学、可靠的“保种”技术，是每个实验人必须掌握的核心技能。
本文将带你深入了解菌株保存的原理，并手把手教你如何建立自己的“菌株银行”，让珍贵的菌株安然沉睡数年甚至数十年。
一、 核心原理：让微生物“休眠”
长期保存的目标并非维持菌株的生长，而是诱导其进入一种代谢近乎停止的“休眠”状态。实现这一目标需要三大关键要素：
- 低温： 极大降低酶活性和代谢速率。温度越低，保存效果越好。
- 干燥： 去除细胞内的自由水，避免冰晶形成对细胞膜和蛋白质造成致命损伤。
- 保护剂： 在冷冻和干燥过程中，保护细胞结构免受伤害。
二、 主流保存方法详解
1. 甘油管冷冻法（最常用、最经济）
这是大多数实验室长期保存菌株的首选方法，适用于大多数细菌和酵母。
原理： 高浓度甘油（终浓度15%-25%）作为冷冻保护剂，渗透进入细胞，降低水的冰点，减少冰晶的形成，从而实现“玻璃化”冻结，保护细胞结构。
操作步骤：
- 准备菌液： 从新鲜平板挑取单菌落，接种于液体培养基中，培养至对数生长中期（OD值约为0.6-0.8，此时菌体活力最强）。
- 配制甘油菌液： 在无菌的菌液中加入等体积的60%无菌甘油（最终菌液:甘油=1:1，甘油终浓度为30%），或直接加入适量80%甘油使其终浓度为15%-20%。充分混匀。
- 分装： 将混合液分装至无菌的冻存管（Cryovial）中，每管约0.5-1mL。
- 标记： 用防水记号笔清晰标记菌株名称、日期、保存人等信息。
- 冷冻：关键步骤！ 先于-20℃冷冻1-2小时，然后转移至-80℃超低温冰箱长期保存。梯度降温能进一步提升存活率。
保存期限： 通常1-10年。
优缺点：
- 优点： 操作简单，成本低，保存时间长，复苏方便。
- 缺点： 依赖-80℃冰箱，停电是最大风险。
2. 斜面/半固体穿刺保存法（短期与备份）
原理： 利用培养基提供营养，在4℃低温下减缓代谢。
操作步骤：
- 将菌株接种在斜面培养基或半固体穿刺培养基上。
- 在适宜温度下培养至生长良好。
- 用封口膜密封试管口，防止培养基干涸，置于4℃冰箱。
保存期限： 细菌1-3个月，酵母2-6个月。
优缺点：
- 优点： 取用方便，无需复苏，可直接划板使用。
- 缺点： 保存时间短，需频繁传代，易发生变异和污染。
3. 液氮冷冻法（黄金标准）
适用于娇贵菌株（如某些真菌、链霉菌）、细胞系以及需要数十年超长期保存的情况。
原理： 在-196℃的液氮中，细胞的代谢活动完全停止，实现“永久”保存。常用保护剂为甘油或DMSO。
操作步骤： 与甘油管法类似，但需要使用专为液氮设计的冻存管，并严格控制降温程序（使用程序降温盒最佳），以防止温度骤降对细胞造成损伤。
保存期限：10年以上，甚至数十年。
优缺点：
-
- 优点： 保存时间极长，稳定性最高。
- 缺点： 成本高，操作复杂，有液氮使用的安全风险。
三、 复苏：唤醒沉睡的“宝藏”
正确的复苏与保存同等重要。不当的复苏方式会导致“冷休克”，使细胞大量死亡。
原则：快速融化，以避免冰晶在缓慢融化过程中重结晶对细胞造成伤害。
步骤：
- 从-80℃冰箱或液氮中迅速取出目标甘油管/冻存管，立即置于37-42℃的恒温水浴槽中，不断摇晃使其在1-2分钟内完全融化。
- 用酒精棉球擦拭冻存管口，在超净工作台中用移液器将菌液全部吸出，接种到新鲜平板或液体培养基中。
- 适宜条件下培养。建议先划一个平板，以确保获得单菌落和纯度。
四、 实验室保种管理最佳实践
- 多重备份原则：
主库： -80℃或液氮中的原始保存管，非紧急情况不动用。
工作库： 从主库复苏后制备的甘油管，用于日常实验。
异地备份： 将最重要的菌株在另一台-80℃冰箱或合作实验室进行备份，以防设备故障。
清晰的记录：
建立电子版菌株库，记录菌株名称、载体、抗性、保存日期、保存位置（如冰箱编号、盒子编号、格子坐标）等。
定期核查：
每年随机抽取1-2支主库菌株进行复苏，验证其存活率和特性（如抗性、表达能力等）。
结语
严谨的菌株保存工作，看似繁琐，实则是实验室数据可靠性和研究可重复性的坚实后盾。投资时间建立一套规范的“保种”体系，就像是为你最珍贵的研究资产购买了最可靠的“保险”。从今天起，用心经营你的“菌株银行”吧，让科学的种子在低温中安然沉睡，在需要时焕发生机。
温馨提示：试剂为科研质控使用，不可用于临床及人体！非药用，非食用。