微生物检测中常见问题及解答！

问题一：样品制备时，为什么需要“充分均质”？到底怎样才算“充分”？

答疑：

“充分均质”的目的是让样品中的微生物尽可能均匀地分散到稀释液中，以保证后续取样的代表性。如果均质不彻底，可能导致：

1. 结果偏差：取到的样液微生物分布不均，导致计数结果重复性差，无法真实反映整体样品的污染情况。
2. 微生物损伤：剧烈或不恰当的均质方式可能会对某些脆弱的微生物（如受伤菌）造成机械损伤，导致计数结果偏低。

怎样才算“充分”？

• 视觉标准：固体样品应完全破碎并悬浮，溶液呈均匀浑浊或乳浊状，无明显大颗粒沉淀。
• 时间标准：通常使用拍击式均质器（Bag Blender）拍击 1-2分钟，或旋转式均质器震荡 2-5分钟。具体时间需根据样品性状（如硬度、粘度）进行验证。
• 关键：所有样品的制备方法应保持一致，以确保数据的可比性。

问题二：培养基灭菌不彻底或过度加热，会有什么影响？

答疑：

• 灭菌不彻底：最直接的影响是引入外来杂菌，导致假阳性结果或平板计数异常增高，实验完全失败。
• 过度加热/反复熔融：

• • 营养成分破坏：培养基中的维生素、碳水化合物等热敏性成分会降解，营养值下降。
  • 选择性变差：选择性培养基中的抑制剂（如胆盐、染料）可能分解，失去对非目标菌的抑制能力。
  • 理化性质改变：琼脂凝固性可能变差，pH值可能发生变化。
  • 产生毒性物质：糖类在高温下可能焦化，产生对微生物生长有抑制作用的物质。

建议：严格按照标准（如121℃, 15-20分钟）进行灭菌，现配现用，避免长时间存放和反复加热。

问题三：为什么一定要做“阳性对照”和“阴性对照”？

答疑：

这是实验室质量控制的基石，用于验证整个实验系统的可靠性。

• 阳性对照：

• • 目的：证明你的培养基、试剂和培养条件能够支持目标微生物的生长。
  • 做法：在检测样品的同时，用标准菌株（如检测大肠菌群就用大肠埃希氏菌）进行同步实验。
  • 结果判读：阳性对照必须长出典型的目标菌落，否则本次样品检测结果无效。
• 阴性对照：

• • 目的：证明你的培养基、试剂和器皿没有被污染。
  • 做法：用无菌的稀释液或PBS代替样品，进行全部实验步骤。
  • 结果判读：阴性对照应该没有任何菌落生长。如果长菌，说明实验过程存在污染，本次检测结果无效。

问题四：菌落计数时，遇到“蔓延菌”或“链状菌落”该怎么数？

答疑：

这是平板计数中最常见的困扰之一。

• 蔓延菌：

• • 成因：某些具有运动性或产荚膜的细菌（如变形杆菌、芽孢杆菌）在琼脂表面扩散生长。
  • 计数方法：

1. 如果蔓延面积不超过平板的一半，可计数未蔓延部分的菌落数，再按比例估算整个平板的菌落数。
2. 如果蔓延面积很大，此平板应弃用，选择菌落数在有效范围内的其他稀释度平板进行计数。
3. 在报告结果时需注明“计入了蔓延菌”。

链状菌落：

• 成因：多个细胞连在一起生长而未分开，形成一个菌落链。
• 计数方法：应计为一个菌落形成单位（CFU）。因为理论上它来源于样品中的一个菌团或一个细胞。

问题五：如何选择最适合的稀释度进行计数？

答疑：

目标是找到菌落数在 30-300 CFU 之间的平板（对于某些特殊方法如霉菌酵母可能要求20-80 CFU）。

• 原则：选择所有稀释度中，菌落数在30-300之间且最接近300的平板进行计数。这样的计数统计学误差最小。
• 常见情况处理：

• • 所有稀释度都<30：报告最低稀释度的菌落数，并注明“估计菌落数”。
  • 所有稀释度都>300：报告最高稀释度的菌落数，并注明“多不可计”（TNTC）。
  • 只有一个稀释度在30-300之间：直接计数该稀释度。
  • 两个连续稀释度都在30-300之间：按标准方法计算两者的加权平均值（如国标GB 4789.2中的公式）。

问题六：无菌室/超净工作台的紫外灯，照射多久才有效？能完全灭菌吗？

答疑：

• 照射时间：常规消毒通常照射 30分钟以上。但紫外灯的灭菌效果受距离、灰尘、湿度等多种因素影响。
• 能完全灭菌吗？—— 绝对不能！

• • 穿透力弱：紫外线无法穿透玻璃、塑料、纸张，也无法照射到物体的背面和缝隙。
  • 只有表面杀菌作用：只能杀死直接暴露在光线下的微生物。
  • 对人体有害：使用时人员必须离开。
• 正确做法：紫外消毒应作为辅助手段，与化学消毒剂（如75%酒精）擦拭和高效过滤器（在超净台内）提供的无菌风流结合使用。操作前用酒精擦拭台面和各种器具表面是关键一步。

问题七：培养基倒入平板后，为什么要“预培养”？

答疑：

预培养（或称“空白培养”）是指将配制好并凝固的培养基平板，在培养箱中放置一段时间（通常为24-48小时），再进行样品检测。

• 主要目的：

1. 检查无菌性：确认培养基在制备和保存过程中未被污染。如果预培养后平板长菌，则该批培养基应废弃。
2. 去除冷凝水：使平板表面的冷凝水蒸发，避免在涂布样品时形成菌落蔓延。
3. “唤醒”培养基：让培养基恢复到室温，避免因温度骤变对某些娇嫩微生物造成冷冲击。

问题八：检测结果出现“异常数据”（如平行样差异巨大）怎么办？

答疑：

首先，不能随意舍弃数据！必须进行系统性的偏差分析。

• 可能原因：

1. 样品不均质：最可能的原因，回到问题一。
2. 操作失误：移液器不准、稀释液混匀不充分、涂布不均匀、倾注平板时培养基过热烫死细菌等。
3. 污染：操作过程中引入外来杂菌。
4. 培养基/试剂问题：批次间差异或质量不稳定。

处理流程：

1. 复核记录：检查原始记录，看操作步骤是否有异常。
2. 分析过程：回顾实验全过程，寻找可能的失误点。
3. 重新检测：如果无法找到明确原因，应安排样品复测。
4. 报告说明：在最终报告中，如实记录所有数据，并对异常情况加以备注说明。

问题九：如何区分培养基的“选择性”和“鉴别性”？

答疑：

这是理解选择性培养基原理的核心。

• 选择性培养基：

• • 目的：“抑制你不想要的，让你想要的生长”。
  • 手段：添加抑制剂，如抗生素、染料、胆盐、高盐等。例如，伊红美蓝琼脂（EMB）中的胆盐可以抑制革兰氏阳性菌，从而“选择”革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）。
• 鉴别性培养基：

• • 目的：“让你能认出它是什么”。
  • 手段：添加指示剂（如pH指示剂）或底物，通过微生物的代谢反应产生可见变化（如变色、产生气泡、出现沉淀）。例如，在EMB上，大肠杆菌会发酵乳糖产酸，形成带有金属光泽的紫黑色菌落，从而被“鉴别”出来。
• 常见培养基：很多培养基是选择-鉴别一体的，如SS琼脂、XLD琼脂等。

问题十：国标、药典、ISO等不同检测标准，该如何选择？

答疑：

标准的选用取决于产品的用途、法规要求和客户约定。

• 基本原则：

1. 强制性标准优先：如果产品有国家强制性标准（如中国的GB 4789系列对于食品），必须遵守。
2. 行业约定：在特定行业（如药品、化妆品），通常遵循《中国药典》或相关的行业标准。
3. 国际贸易：出口产品通常需要符合进口国的标准（如美国FDA的BAM、欧盟的ISO标准）。
4. 客户要求：满足客户在合同或协议中指定的检测方法。

关键点：

• 不同标准在样品处理、培养基、培养条件和判读标准上可能存在细微差异，从而影响结果。
• 实验室在选择标准后，必须进行方法验证，证明有能力按照该标准正确执行检测。
• 在同一批次的检测中，不能混用不同标准。