1.菌种：
- 革兰氏阳性菌：例如金黄色葡萄球菌
- 革兰氏阴性菌：例如大肠杆菌
- 产芽孢菌：例如枯草芽孢杆菌
2.染料与试剂：
- 革兰氏染色液：结晶紫、碘液、95%酒精（脱色剂）、沙黄或稀释石炭酸复红（复染剂）
- 芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液
3.仪器与耗材：
- 显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊子、染色架、香柏油、擦镜纸
4.安全注意事项：
- 穿实验服，戴手套。
- 使用酒精灯时注意防火，操作完毕立即熄灭。
- 处理细菌培养物时遵循无菌操作原则，避免污染和感染。
- 废弃玻片应放入消毒缸中。
第一部分：革兰氏染色
革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法，可将绝大多数细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。
操作步骤
第一步：涂片制备
- 标记：取一张洁净载玻片，用记号笔在背面标记区域（如“G+”和“G-”）。
- 加水：在每个标记区域中央滴一小滴无菌水。
- 接种：用灭菌冷却后的接种环，分别挑取少量菌苔，在水滴中轻轻涂抹开，形成一层薄而均匀的菌膜。
- 固定：让涂片在空气中自然干燥。然后，将载玻片菌膜面向上，快速通过酒精灯火焰2-3次进行热固定。目的是杀死细菌，使其牢固附着在玻片上。
第二步：初染 - 结晶紫
- 用结晶紫染液覆盖整个菌膜。
- 染色1分钟。
- 用细缓水流从玻片一侧轻轻冲洗，洗去多余染液。
第三步：媒染 - 碘液
- 用碘液覆盖菌膜。
- 媒染1分钟。
- 用水轻轻冲洗。
第四步：脱色 - 95%酒精（最关键的一步）
- 将玻片倾斜，用滴流法脱色。用95%酒精连续冲洗菌膜，直到流下的酒精几乎无色或呈淡紫色为止。
- 时间非常关键：通常约为 20-30秒。过度脱色会导致阳性菌被误判为阴性；脱色不足则会导致阴性菌被误判为阳性。
- 立即用水轻轻冲洗，终止脱色。
第五步：复染 - 沙黄
- 用沙黄染液覆盖菌膜。
- 复染1分钟。
- 用水轻轻冲洗。
- 用滤纸轻轻吸干水分，或置于空气中自然晾干。
结果观察
- 滴油镜检：在干燥的菌膜上滴一滴香柏油，使用油镜观察。
- 结果判读：
- 原理：细胞壁肽聚糖层薄，脂质含量高，酒精溶解了外膜的脂质，使得结晶紫-碘复合物被洗脱，从而被沙黄复染成红色。
- 原理：细胞壁肽聚糖层厚，交联紧密，与结晶紫-碘复合物结合牢固，不易被酒精脱色。
- 革兰氏阳性菌：菌体呈蓝紫色。
- 革兰氏阴性菌：菌体呈红色或粉红色。
第二部分：芽孢染色
芽孢是某些细菌在不利环境下形成的休眠体，具有厚而致密的壁，普通染色法不易着色。芽孢染色法通过强染剂和加热促使染料进入芽孢，再通过脱色区分芽孢和菌体。
操作步骤
第一步：涂片制备
与革兰氏染色相同，制备枯草芽孢杆菌的涂片并进行热固定。
第二步：初染 - 孔雀绿
- 用孔雀绿染液完全覆盖菌膜。
- 加热染色：手持玻片，在酒精灯火焰上方微微加热，使染液冒蒸汽但切勿煮沸或蒸干。加热过程中随时添加染液，保持玻片湿润。
- 持续5-7分钟。加热能帮助染料穿透芽孢的致密结构。
- 待玻片冷却后，用细缓水流彻底冲洗。
第三步：脱色 - 水
- 用自来水轻轻冲洗，直到流下的水无色或呈淡绿色。此步是为了脱去菌体上的颜色，而芽孢内的染料因其结合紧密不易被洗脱。
第四步：复染 - 沙黄
- 用沙黄染液覆盖菌膜。
- 复染1-2分钟。
- 用水轻轻冲洗。
- 用滤纸吸干或自然晾干。
结果观察
- 滴油镜检：使用油镜观察。
- 结果判读：
- 芽孢：呈亮绿色（或初染剂的颜色）。
- 菌体：呈红色（复染剂的颜色）。
- 原理：孔雀绿在加热条件下能进入芽孢和菌体，但冷却后，菌体内的孔雀绿被水洗脱，而芽孢内的染料则被保留。随后沙黄将菌体复染成红色，形成鲜明对比。
常见问题
| 问题 |
|
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|---|---|---|
| 革兰氏染色不理想 | ||
| 阳性菌呈红色 | 脱色过度；菌种老化（失去细胞壁完整性） | 严格控制脱色时间（20-30秒）；使用新鲜培养物（18-24小时） |
| 阴性菌呈紫色 | 脱色不足；涂片过厚 | 延长脱色时间；制备更薄的菌膜 |
| 染色结果不均一 | 涂片不均匀；水洗水流过猛 | 确保菌膜薄而均匀；轻柔水洗 |
| 芽孢染色不理想 | ||
| 芽孢不着色 | 加热不足；染色时间太短 | 确保加热至冒蒸汽并维持足够时间 |
| 菌体背景过深 | 脱色（水洗）不彻底 | 延长水洗时间，彻底冲洗 |
| 看不到芽孢 | 菌种不产孢或产孢率低 | 使用专用产孢培养基或延长培养时间（如培养48-72小时） |
总结
通过这两个经典的染色实验，你不仅能够掌握微生物学的基本操作技能，还能深刻理解细菌细胞结构（如细胞壁、芽孢）与其生理特性及染色行为之间的关系。多加练习，你就能熟练地通过显微镜下的色彩来解读微生物的世界。祝您实验顺利！
温馨提示：试剂为科研质控使用，不可用于临床及人体！非药用，非食用。