微生物冻干粉菌种能否多次复苏？菌种保存与使用详解

在微生物实验室的日常工作中，菌种的保藏与复苏是一项基础却至关重要的技术。其中，真空冷冻干燥法（冻干）制备的冻干粉菌种因其保存期长、存活率高、稳定性好而被视为中长期保存的“金标准”。一个常见且关键的问题是：这类冻干粉菌种能否多次复苏使用？ 答案是：理论上可以，但强烈不建议这样做。最佳实践是“一次复苏，永久传承”。

本文将深入探讨其原因，并详细解析菌种保存与使用的科学方法。

一、 核心问题：为何不推荐多次复苏同一支冻干粉？

虽然一支冻干粉管中含有成千上万个微生物细胞，但多次打开和取用会带来一系列不可逆的风险：

每次打开胶塞，菌种都暴露在空气中，极大增加了被环境中杂菌（细菌、真菌、噬菌体等）污染的可能性。一旦污染，整支珍贵的原始菌种将彻底报废，无法挽回。

冻干粉的核心是在真空、干燥状态下长期休眠。每次操作都会引入空气中的水汽，导致瓶内湿度上升。吸湿后的冻干粉会逐渐失去干燥状态，微生物活性加速下降，甚至发生死亡，使其无法再次成功复苏。

取菌时，即使使用严格的无菌操作，也难以避免地会吹散或带走部分冻干粉颗粒。多次取用会导致剩余菌粉量减少，有效活菌数下降，最终可能不足以支持下一次复苏。

反复的休眠-复苏循环是一种强烈的环境压力。这种压力可能会筛选出那些复苏能力强但可能已经发生了表型或基因型改变的亚群，导致原始菌种的特性（如产酶能力、致病性、抗生素产量等）发生改变或退化，失去其应有的研究和应用价值。

结论： 应将每一支冻干粉菌种视为一次性使用的“种子”。一旦开启复苏，就应通过传代培养的方式制备新的工作菌株，而将原始冻干粉或复苏后制备的备份菌种妥善保存，以备将来之用。

二、 菌种保存策略详解：

一个完善的实验室应建立分级的菌种保存体系，以确保菌种的纯净性、稳定性和可持续性。

• 第一级：原始冻干粉（Master Stock）

• • 身份：最原始、最可靠的菌种来源，通常购买自标准菌种保藏中心（如ATCC, DSMZ, CICC等）。
  • 保存：置于-20℃或更低的冰箱中长期保存。
  • 使用：仅用于复苏创建第二级种子库，绝不用于日常实验。
• 第二级：备份菌种库（Backup Stock）

• • 来源：复苏原始冻干粉后，通过平板划线分离出单菌落，验证其纯度和特性后，制备成新的冻干粉或甘油管（-80℃）。
  • 保存：与原始冻干粉分开存放，作为安全备份。
  • 使用：当工作菌种库出现问题或需要重新开始时使用。
• 第三级：工作菌种库（Working Stock）
• 来源：从备份菌种库复苏后制备。常用方法包括：

• • 斜面短期保存：4℃保存，可存活1-3个月，方便日常取用。
  • 甘油管冷冻保存：菌液与无菌甘油混合后置于-80℃，可保存1-2年，是最常用的工作菌种保存方式。
  • 使用：用于日常实验、接种发酵罐等。

通过这种金字塔式的管理，即使某一级别的菌种出现问题，也可以随时向上溯源，确保实验的连续性和数据的可靠性。

三、 冻干粉菌种的正确复苏与使用流程

正确的复苏操作是保证菌种活性的第一步。

准备工作：

• 生物安全柜（超净工作台），已紫外灭菌。
• 合适的液体培养基（复苏专用或普通培养基）。
• 无菌吸管（1mL）或移液器及无菌吸头。
• 试管、平板等。
• 镊子、酒精灯。

复苏步骤：

1、平衡与消毒：将冻干粉菌种管和培养基从冰箱取出，室温放置片刻，避免温差过大。用酒精棉球彻底擦拭安瓿瓶或胶塞管的顶部。

2、开启：

• 安瓿瓶：用锉刀在颈部锉一道痕，然后用酒精棉球擦拭后徒手掰开（需小心）。
• 胶塞管：用镊子轻轻撬开胶塞，或直接撕开预切口铝盖。

3、重悬：向管内加入约0.5-1mL无菌液体培养基，用吸管轻轻反复吹吸，使冻干粉完全溶解并重悬，形成菌悬液。

4、转移与培养：将全部菌悬液吸取并转移到含有5-10mL液体培养基的试管中（富集培养），或吸取少量（如0.1mL）涂布到固体平板上（分离单菌落）。

5、孵育：将试管或平板置于该菌种最适温度下培养。通常建议先观察24-48小时。

6、验证：培养成功后，务必通过显微镜观察、革兰氏染色或平板划线等方法验证菌种的纯度和活性。

复苏成功后，应立即：

• 进行平板划线，分离出单菌落，以确认无污染并获得纯培养。
• 挑取单菌落进行扩增，并制备新的甘油备份管（工作菌种库）和斜面（短期使用）。
• 记录：详细记录复苏日期、菌种代次、保存位置等信息。

总结

微生物冻干粉菌种是宝贵的生物资源，而非消耗品。切忌多次复苏同一支冻干粉。正确的做法是建立并遵循分级菌种保存制度：将原始冻干粉作为“火种”，一次复苏后即制备大量后备菌种和工作菌种，通过科学的传代和保藏方法，确保您的菌种能够稳定、纯净地传承下去，为科研和生产实验的可靠性与重复性奠定坚实基础。