一、 实验前准备
1. 器具与试剂：
无菌稀释液：最常用的是生理盐水（0.85% NaCl），或磷酸盐缓冲液。确保在有效期内且无菌。
无菌试管：用于分装稀释液，通常准备9mL/管。
无菌吸头/移液管：量程需覆盖1mL和0.1mL（或1mL及后续稀释转移量）。必须是无菌的！
微量移液器：定期校准，确保精度。
均质袋/均质杯：用于固体或半固体样品的初始均质。
涡旋振荡器：用于充分混匀样品。
标记笔：防水，能在玻璃或塑料上清晰书写。
培养皿和培养基：预先准备好并标记清楚。
2. 环境与个人准备：
超净工作台/生物安全柜： 所有稀释操作必须在无菌环境下进行。使用前开启紫外灯灭菌30分钟，并用75%酒精擦拭台面。
个人防护： 穿实验服，戴手套、口罩和帽子。手套用酒精消毒。
二、 梯度稀释详细步骤（以10倍系列稀释法为例）
假设您有一个液体样品，预计菌落总数为 10⁶ CFU/mL。
第1步：样品均质
对于液体样品，剧烈振摇数次，确保微生物分布均匀。
对于固体样品，按标准（如1：10）加入稀释液，在均质袋中充分拍击或均质器上均质1-2分钟。
第2步：设置稀释梯度与标记
规划梯度： 根据样品类型和预估菌量，设计稀释度。对于预估10⁶ CFU/mL的样品，通常选择10⁻⁴， 10⁻⁵， 10⁻⁶ 三个稀释度进行涂布或倾注平板。
清晰标记： 在每一支含9mL稀释液的试管上，清晰地标记稀释度：
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- 10⁻¹， 10⁻²， 10⁻³， 10⁻⁴， 10⁻⁵， 10⁻⁶ （多准备几个以备不时之需）
- 同时在培养皿上标记好样品编号、稀释度和日期。
第3步：进行系列稀释（核心操作）
原则：从低浓度向高浓度操作，即“从低往高吹”。
1、制备10⁻¹稀释液：
用无菌移液器吸取 1mL 原样品。
将吸头尖端伸入标记为“10⁻¹”的试管液面以下，缓慢、平稳地将液体打出。
将试管盖紧，立即在涡旋振荡器上振荡混匀10-15秒，确保微生物充分分散。此为10⁻¹稀释液。
2、制备10⁻²稀释液：
更换一个新的无菌吸头！
从刚刚混匀的“10⁻¹”试管中吸取 1mL 液体。
将吸头伸入“10⁻²”试管液面下，缓慢打出液体。
盖紧试管，涡旋振荡混匀。此为10⁻²稀释液。
3、制备后续稀释液：
重复上述步骤：更换吸头 → 从上一个稀释度吸取1mL → 加入下一个9mL试管 → 涡旋混匀。
依次制备出10⁻³， 10⁻⁴， 10⁻⁵， 10⁻⁶等稀释液。
第4步：接种与培养
选择2-3个最可能落在30-300 CFU范围内的稀释度（本例中为10⁻⁴， 10⁻⁵， 10⁻⁶）进行接种。
每个稀释度建议做2-3个平行平板，以提高结果的准确性。
涂布法： 吸取0.1mL稀释液到固体培养基表面，用无菌涂布棒涂匀。
倾注法： 吸取1mL稀释液至无菌平皿中，然后倒入约15-20mL冷却至45-50℃的熔融培养基，立即轻轻摇匀。
按照目标微生物的培养条件进行培养。
三、 误差控制要点与技巧
误差控制是获得可靠数据的关键。主要误差来源及控制方法如下：
1. 移液误差
定期校准移液器： 这是最容易被忽视但至关重要的一点。
正确使用移液器：
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- 吸液时保持垂直，慢吸慢放。
- 对于高粘度样品，采用“反向移液法”，可以提高精度。
- 预润洗吸头：对于某些样品或稀释液，先吸放一次液体，使吸头内壁达到平衡，可以提高准确性。
使用合适的吸头： 使用与移液器品牌匹配的高质量无菌吸头。
2. 交叉污染
一管一吸头： 绝对禁止 用一个吸头接触两个不同浓度的稀释液。这是导致梯度失败最常见的原因。
操作顺序： 严格遵守 “从低浓度到高浓度” 的顺序。这样即使有微量液体溅出，也不会污染更高浓度的样品。
避免产生气溶胶： 吹打液体时，动作要轻柔，吸头尖端始终保持在液面以下，避免产生气泡和气溶胶。
3. 混合不充分
必须涡旋振荡： 每次移液前，都必须将试管充分涡旋振荡。简单颠倒混匀往往不足以使微生物细胞均匀分散，导致同一稀释度的平行平板间计数差异巨大。
时间要保证： 每次振荡10-15秒是必要的。
4. 时间与温度误差
快速操作： 从样品制备到稀释完成，再到接种，时间应尽可能短。微生物在稀释液中会因营养缺乏、pH变化等而死亡或增殖。
控制温度： 对温度敏感的样品，整个稀释过程应在冰上进行，但需注意稀释液温度过低可能对某些微生物造成冷休克。
5. 稀释液与器具
确认无菌： 使用前检查稀释液和试管的有效期及无菌状态。
质量保证： 确保稀释液的pH和渗透压适合目标微生物的存活。
6. 设置对照
稀释液空白： 取1mL稀释液加入平板中，进行与样品相同的操作，以确认稀释液和器具无菌。
环境监测： 在操作过程中，打开一个空的培养皿放置几分钟，以监测超净工作台的无菌状况。
四、 结果判读与常见问题
选择可计数平板： 优先选择菌落数在30-300 CFU之间的平板。如果一个稀释度的两个平板都在此范围，取平均值。如果一个高于300，一个低于30，且两者倍数关系不大，则数据可能不可靠，需重做。
常见问题分析：
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- “跳管”现象： 某个稀释度的计数远高于或低于预期。原因通常是移液错误、未换吸头导致交叉污染、或混合不充分。
- 所有平板菌落都过多（>300）： 初始稀释度设置过低，下次检测需增加稀释梯度。
- 所有平板菌落都过少（<30）： 初始稀释度设置过高，或样品本身含菌量极低。
- 平行平板差异巨大： 最可能的原因是混合不充分或移液操作不规范。
总结：
成功的微生物稀释操作 = 规范的操作流程 + 严谨的无菌观念 + 对细节的极致关注。将上述步骤和误差控制要点内化为习惯，是获得可靠微生物定量数据的基石。
温馨提示：试剂为科研质控使用，不可用于临床及人体！非药用，非食用。