估计悬液中的细菌浓度是微生物学实验中的常见任务，有多种方法可以实现，选择哪种方法取决于实验目的、设备条件、所需精度以及细菌种类等因素。以下是几种常用的方法：
1. 平板计数法（Standard Plate Count, SPC）
- 原理：将样品进行系列稀释后涂布或倾注于固体培养基上，培养后计数菌落形成单位（CFU, Colony Forming Units）。
- 步骤简述：
- 对原始悬液进行10倍系列稀释（如10⁻¹, 10⁻², ..., 10⁻⁶）。
- 取一定体积（通常为0.1 mL或1 mL）涂布于琼脂平板或与熔化的琼脂混合。
- 在适宜条件下培养（如37℃，24–48小时）。
- 计数菌落数在30–300之间的平板。
- 优点：结果反映活菌数量。
- 缺点：耗时长（需培养），操作繁琐。
2. 光密度法（OD600 测定）
- 原理：利用分光光度计在600 nm波长下测定细菌悬液的吸光度（OD₆₀₀），其值与细胞密度成正比。
- 步骤简述：
- 将悬液混匀。
- 用分光光度计测 OD₆₀₀（必要时用空白培养基调零）。
- 利用标准曲线将 OD 值转换为细胞浓度（cells/mL）。
- 注意：不同菌种的 OD 与细胞数关系不同，需提前建立标准曲线（通过平板计数或显微镜计数校准）。
- 优点：快速、无损、适合动态监测生长。
- 缺点：不能区分死/活细胞；高浓度时可能超出线性范围（通常 OD₆₀₀ < 0.5）。
3. 显微镜直接计数法（如血球计数板或细菌计数板）
- 原理：在显微镜下直接观察并计数已知体积内的细菌数量。
- 工具：血球计数板（适用于较大细胞）或专用细菌计数室（如Petroff-Hausser计数室）。
- 步骤简述：
- 将悬液适当稀释（避免重叠）。
- 加样至计数室。
- 显微镜下计数特定方格内的细菌。
- 按公式换算浓度（cells/mL）。
- 优点：快速，可得总菌数（包括死菌）。
- 缺点：对低浓度样品不敏感；难以区分死/活菌；小细菌不易看清。
4. 流式细胞术（Flow Cytometry）
- 原理：利用荧光染料（如SYTO 9标记活菌，PI标记死菌）结合激光检测单个细菌。
- 优点：高通量、可区分活/死菌、精确。
- 缺点：设备昂贵，需专业操作。
5. 浊度比色法（McFarland 标准）
- 原理：通过比较悬液浊度与 McFarland 标准管（含特定浓度的 BaSO₄ 悬液）来粗略估计细菌浓度。
- 常用于：临床微生物实验中制备标准化接种物（如 0.5 McFarland ≈ 1–2 × 10⁸ CFU/mL，依菌种而异）。
- 优点：简便快速。
- 缺点：精度低，仅作粗略估计。
总结对比
| 方法 | 是否区分活/死 | 精度 | 速度 | 设备要求 |
|---|---|---|---|---|
| 平板计数 | 是（活菌） | 高 | 慢 | 基础 |
| OD₆₀₀ | 否 | 中 | 快 | 分光光度计 |
| 显微镜计数 | 否 | 中 | 中 | 显微镜+计数板 |
| 流式细胞术 | 是 | 高 | 快 | 高端 |
| McFarland 比浊 | 否 | 低 | 极快 | 目视或比浊仪 |
实际建议
- 若需活菌浓度 → 优先选平板计数法。
- 若需快速估算或生长曲线 → 用OD₆₀₀ + 标准曲线。
- 若需总菌数且设备有限 → 考虑显微镜计数。
- 若资源充足且要求高精度 → 使用流式细胞术。
温馨提示：试剂为科研质控使用，不可用于临床及人体！非药用，非食用。
