标准菌株怎么传代才不退化？保藏与复苏关键步骤

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为确保标准菌株在传代过程中不发生退化、污染或变异，必须严格遵循规范的活化—传代—保藏—复苏流程。以下是基于现行标准（如《SN/T 2660-2010》《GB 4789.28-2013》等）和实验室最佳实践总结的关键操作要点：

一、防止菌株退化的关键原则文章源自：微生物菌种网https://www.junzhucn.com微生物菌种网-https://www.junzhucn.com/weishengwu/zhishi/806.html

1、严格控制传代次数文章源自：微生物菌种网https://www.junzhucn.com微生物菌种网-https://www.junzhucn.com/weishengwu/zhishi/806.html
  • 标准菌株从保藏中心获得为 0代；
  • 首次活化后制备的冷冻保存株为 第1代（储备菌株）；
  • 工作菌株通常使用 第2–4代；
  • 严禁超过5代使用，除非有完整的生化/分子验证证明未变异。

2、避免反复冻融与频繁传代文章源自：微生物菌种网https://www.junzhucn.com微生物菌种网-https://www.junzhucn.com/weishengwu/zhishi/806.html

  • 每次使用应从同一支冷冻储备管中取用，避免多次解冻同一管；
  • 储备菌株只用于制备工作菌株，不直接用于实验。

3、使用合适保藏方法延长稳定性文章源自：微生物菌种网https://www.junzhucn.com微生物菌种网-https://www.junzhucn.com/weishengwu/zhishi/806.html

  • 推荐：甘油管（-80℃）、冻干粉、瓷珠法；
  • 短期可用：斜面+液体石蜡（4℃，1–3个月），但需定期转接。

4、保持培养条件一致性文章源自：微生物菌种网https://www.junzhucn.com微生物菌种网-https://www.junzhucn.com/weishengwu/zhishi/806.html

  • 使用标准培养基（如LB、营养琼脂等）；
  • 避免在单一培养基上连续多代传代，可轮换不同类型培养基（尤其对食用菌或工业菌种）。

二、标准菌株传代规范流程文章源自：微生物菌种网https://www.junzhucn.com微生物菌种网-https://www.junzhucn.com/weishengwu/zhishi/806.html

步骤1：接收与建档文章源自：微生物菌种网https://www.junzhucn.com微生物菌种网-https://www.junzhucn.com/weishengwu/zhishi/806.html

  • 建立菌株管理台账：记录来源（如ATCC/CMCC）、编号、接收日期、代数、保存方式等。

步骤2：首次活化（0代 → 1代）文章源自：微生物菌种网https://www.junzhucn.com微生物菌种网-https://www.junzhucn.com/weishengwu/zhishi/806.html

  • 按说明书复苏（如冻干管加无菌水、甘油管划线等）；
  • 接种至非选择性培养基（如TSA、NA），适宜温度培养；
  • 挑取单菌落进行纯化（确保无杂菌）。

步骤3：“体检”验证文章源自：微生物菌种网https://www.junzhucn.com微生物菌种网-https://www.junzhucn.com/weishengwu/zhishi/806.html

  • 形态观察：菌落大小、颜色、边缘是否一致；
  • 革兰氏染色：确认细胞形态与预期一致；
  • 生化试验（如氧化酶、糖发酵等）：验证典型特性；
  • 必要时做分子鉴定（如16S rRNA测序）。

步骤4：制备储备菌株（1代）文章源自：微生物菌种网https://www.junzhucn.com微生物菌种网-https://www.junzhucn.com/weishengwu/zhishi/806.html

  • 制成甘油终浓度15–20%的菌悬液（细胞浓度约10⁸–10¹⁰ CFU/mL）；
  • 分装至无菌冻存管，-80℃超低温冰箱保存；
  • 或制成冻干粉、沙土管等长期保藏形式。

甘油管配制示例：

配40% (v/v) 甘油水溶液，121℃灭菌；

取500 μL甘油液 + 500 μL新鲜菌液 → 混匀 → -80℃保存。

步骤5：工作菌株制备（1代 → 2–4代）

  • 从1代储备管快速解冻（手握或37℃水浴<1分钟）；
  • 立即接种至新鲜培养基活化；
  • 再次验证纯度与特性；
  • 可直接用于实验，或短期4℃斜面保存（≤1个月）。

三、菌种复苏关键步骤（以甘油管为例）

  1. 无菌操作：全程在超净工作台进行；
  2. 快速解冻：避免冰晶损伤细胞；
  3. 立即接种：解冻后不可放置，应立刻划线或接入液体培养基；
  4. 适宜培养：按菌种要求设置温度、时间、摇床转速（如37℃, 180 rpm, 12–16 h）；
  5. 验证复苏效果：观察生长状态、纯度、典型特征。

四、销毁与记录

  • 污染、老化、超代菌株必须高压灭菌（121℃, 30 min）后丢弃；
  • 所有操作（活化、传代、使用、销毁）均需详细记录于菌株台账，包括：日期、操作人、代数、培养基、验证结果、用途、保存位置等。

温馨提示：试剂为科研质控使用，不可用于临床及人体！非药用，非食用。

 
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